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师兄，我要emo了，这次的实验数据很不理想。

别着急，你和我详细说说。

数据的重复性不好，扩增曲线也杂乱无章！

是不是没有使用ROX校正呀？我们实验室里的qPCR仪是需要ROX校正的。

还需要设置ROX校正？师兄，你快教教我！

那我们一起来学习一下吧！

ROX是一种惰性参比染料，能被qPCR仪检测到，但在PCR反应过程中，ROX的荧光信号不随扩增而改变，始终保持在一个稳定的水平上，不会对qPCR反应产生影响。

实验过程中有很多因素会引起孔间差异，比如：反应体系浓度、仪器的物理特性、移液操作以及耗材质量等，因此，可以将ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，从而提高数据的精确度。

1.确保反应体系中ROX浓度与所用qPCR仪器的要求相匹配。

2.在设计实验时，不应选择与ROX波长重叠的荧光基团，以避免ROX与荧光探针发生干扰。

3.在购买MIX型试剂时，要确认试剂中是否已含ROX，避免重复添加。

4.PCR软件通常会默认使用ROX并进行归一化计算，若试剂本身不含ROX或者实验不需要进行ROX校正，就需要修改软件设置，将被动参考选项改为无，以避免发生错误。

5.在qPCR实验中，ROX的加入应保证在所有样品和反应体系中保持一致，确保实验的稳定性和重复性。

BadRox报错通常是指在荧光定量PCR过程中ROX浓度与仪器机型不匹配（过高或过低）导致的荧光强度差异，从而影响实验结果的准确性。

由于光学激发系统的差异，qPCR仪器对ROX染料浓度的需求也不同，目前市售的qPCR设备大致可以分为三类：不需要ROX校正的、需要高浓度ROX校正的以及需要低浓度ROX校正的。

因此，为避免BadRox报错，要提前了解设备对ROX浓度的需求，配制对应浓度的反应液；若选择qPCR预混试剂，应注意使用与仪器相兼容的预混液，确保其ROX浓度符合要求。若出现BadRox报错问题，先不用急着重复实验，可以在仪器设置中取消ROX的校正功能，若扩增曲线恢复正常且数据的重复性好，则数据还可以用。