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qPCR引物探针设计原来这么简单！
发布时间：
2024-03-15
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qPCR实验中，引物设计是非常重要的一个环节，决定着实验的成败。您是不是也时常为qPCR引物设计感到苦恼，小优在后台整理了引物设计的干货，希望对您有帮助，一起来看看吧！
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种在PCR过程中通过加入荧光标记物质来实时追踪和量化PCR产物的技术。根据荧光标记物的不同，可分为两种类型：一种是使用SYBR Green I这类荧光染料的方法；另一种是使用荧光探针如TaqMan的方法。
无论使用哪种方法，预先设计反应性能良好的引物都是非常重要的步骤，在探针法qPCR中，需要同时考虑引物和探针的质量，设计上更加繁琐。
PART.01
qPCR引物设计原则
1
引物设计位置
测试基因表达量变化的引物最好跨内含子设计，这样可以限制基因组DNA模板扩增，从而避免gDNA污染造成的影响；引物设计区域应避开复杂二级结构，可以先通过专业软件预测靶序列是否存在二级结构，因为扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行。
2
引物/扩增产物长度
引物长度一般在18~25nt之间，但不应大于38nt；扩增产物长度尽量控制在80~200bp之间，尽量不超过300bp。
3
GC含量和Tm值
引物GC含量控制在40%~60%之间，正反向引物GC含量应接近，以便获得相近的Tm值和退火温度；上下游Tm值应尽量接近，一般为60℃左右，可使用专用软件来计算Tm值。
4
互补性与特异性
引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补（3个碱基以上），引物自身互补会形成发夹结构而影响引物与模板之间的复性结合，而引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性；引物扩增的是目标特异产物，如果出现非特异性扩增，定量就会不准确，可使用BLAST比对，确认引物的特异性。
5
引物序列要求
整体上引物的碱基分布最好是随机的，相同的碱基不能连续排列超过3个；局部应避免高GC或高AT区（尤其3′端）；3'末端碱基最好为G或C，3′端末端尽量避免为A。
PART.02
qPCR探针设计原则
采用探针法qPCR检测时，需要同时考虑引物和探针的质量。通常首先要确定合适的探针位置，再进行引物的设计，设计上比采用荧光嵌合法的引物设计更加困难和繁琐。
1
探针位置
探针位置尽可能地靠近上游引物，但需避免重叠，确保在扩增时第一时间水解探针发出荧光信号。应先选择好探针的位置，再设计引物。
2
探针长度
探针的长度控制在25~32nt之间，尽量不要超过35nt。
3
探针Tm值
探针的Tm值要比引物Tm值高8-10℃，保证在退火时探针先于引物与目的片段结合。
4
互补性与特异性
探针自身与两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列，连续的互补序列容易形成二级结构，从而影响与模板的结合效率；同样，设计时可使用BLAST检索，确认探针的特异性，从而避免与非目标序列互补。
5
探针序列要求
整体上碱基不能过偏，最好是富含CG的保守片段，可以保证较高的Tm值；应当尽量确保C比G多，因为G碱基过多可能导致形成复杂的二级结构；探针的5'端避免使用G，当单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，会导致FAM基团发出的荧光信号被淬灭。
PART.03
设计小妙招
引物和探针的设计虽然复杂，但通常可以使用引物设计专用软件（如Primer Premier、Oligo 7等）设计引物和探针，也可以利用NCBI网站功能，这样就无需下载软件来设计引物，还可以直接进行特异性的比对，非常方便！
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主要产品包括核酸工具酶及PCR相关产品，可应用于传染疾病诊断、优生优育诊断、肿瘤标志物筛查、心血管疾病诊断、食品安全检测、下一代测序、分子生物学研究等领域。
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