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1、菌液培养时间：使用TB培养基培养菌液的时间一般在16小时左右，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳，培养时间短会导致菌体生长不充分，培养时间过长菌体会出现死亡，导致活菌比例降低，进而基因组DNA污染概率增大。培养时间应优选的控制在12-16 h内。

2、菌液较多：可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低，菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解，导致导致提取量和纯度偏低。

3、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加裂解液的用量。并确保细菌混悬均匀。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分，要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

4、宿主菌株：宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5α进行质粒纯化。

5、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体，或者加大提取的菌液量，并减小洗脱时的体积。当所提取的质粒大于10 kb时，由于菌体承载力有限，大质粒复制效率往往会低于普通质粒，因此推荐增大菌液量以获得更好的提取产量。

6、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况，导致无法提出质粒，若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

7、溶液使用不当：溶液II在温度较低时可能出现浑浊，可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液，方可使用。

8、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

9、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

10、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，可置于室温静置20-30分钟，或放到超净台上风吹15分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、盐离子污染：当漂洗操作不当或漂洗不充分时将导致盐离子污染，该指标可通过OD260/230比值鉴定，通常大于2.0是可接受的。在使用试剂盒时应确保Wash Buffer的漂洗次数和漂洗液加入量。

11、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位，可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。

12、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。为追求高浓度质粒而减小洗脱液体积将会导致洗脱不充分进而降低产量，因此要确保洗脱液的用量，此外Elution Buffer预热至60℃和重复洗脱将更有利于洗脱效率提升。

13、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

14、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。

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