为何要提取 RNA

基因组DNA中包含表达与不表达的基因，只有转录后的RNA才能反映出基因的表达情况。但 RNA 的表达量随外界环境、时间均有所不同，想要得到不同处理或者不同样本中基因的表达变化就要对 RNA 进行实时监测。

注：荧光定量PCR只是一种技术平台，既可以检测mRNA的表达变化，也可以检测基因组DNA的变化。若要检测基因突变或者研究某个蛋白结合基因组DNA的情况，可以提取基因组DNA再做荧光定量。

样本制备及提取

提取：

1.待提取样本需在正确的条件下储存（液氮/-80度）。

2.根据样本类型及特点选择合适的提取方式（液氮研磨/破碎仪/超声破壁/裂解；柱式法/试剂法/磁珠法）。

3.在RNA提取的过程中要消除环境中的RNase污染，防止RNA降解。

检测：

分光光度计可以检测RNA浓度，而蛋白核酸检测仪可对RNA浓度和纯度进行同时检测。

260/280用于评估蛋白污染，最佳OD值为 1.8-2.2，>2代表有胍盐残留或者RNA降解，<1.8代表蛋白或苯酚残留。

260/230用于评估有机溶剂残留，若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 

RNA完整度可用琼脂糖凝胶电泳检测

理论上，RNA琼脂糖电泳会出现2-3条带，完整的 RNA 28S：18S 亮度比值约为 2：1。但应注意对于植物样本来说有可能存在叶绿体RNA干扰，条带数量大于4条，并不表示RNA发生降解。

RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。

逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。

根据实验目的，逆转录引物可以从Oligo dT，随机引物（Random hexamers）和基因特异性引物（GSP）中进行选择。

Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，因此主要用于逆转带有Poly(A)尾的mRNA。适合长链及全长RNA的逆转录，真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT。

随机引物，目的片段在RNA任何位置都能使用，它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录，对于目标区域具有复杂二级结构/GC含量较高，或者来源为原核生物的模板也同样适应。

基因特异性引物是根据目标RNA的已知序列进行设计的，由于引物和RNA序列特异性结合，在使用基因特异性引物时，不能进行其他基因的检测，通常特异性引物用于一步RT-qPCR实验中。

Random+Oligo dT Primer组合适用于各种RNA的表达量分析，能够提升反应检测的灵敏度，更适用于荧光定量PCR前的逆转录反应。优基生物荧光定量前逆转录产品Q1004A及Q1005A中，逆转录引物均为Random+Oligo dT Primer组合。