PCR，即聚合酶链式反应，是一种在体外快速并大量复制目的DNA片段的技术。但是在PCR实验中，往往会出现一些异常的情况。本期小优给大家搜集了一些平时经常遇到的问题，并对可能存在的原因和相应的解决方案进行了汇总，希望对大家有所帮助。

(1) PCR反应组分不准确或组分不起作用

检查使用的组分是否有问题，比如：Taq DNA聚合酶是否失活、引物序列是否正确、引物是否降解等。更换新的组分再重新进行实验。

(2) 模板有问题

a.模板中含有杂质（或抑制物）：模板中存在蛋白质、多糖等杂质可能抑制PCR反应，比如甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。可以将模板纯化后再使用。

b.体系中添加的模板量低导致无法有效扩增：在体系允许的范围内加大模板的用量。

c.模板已经降解：重新制备模板后进行实验。

(3) PCR程序或电泳有问题

a.检查变性温度是否准确：温度过高会导致酶在前几个循环就迅速失活；过低会使模板变性不彻底。根据使用的试剂说明书设置变性温度。

b.退火温度太高：适当降低退火温度，或者设置温度梯度来优化反应温度。

c.延伸时间太短：根据选用的PCR试剂和扩增的片段长度重新设置延伸时间。

d.检查电泳条件及上样操作是否有误。

PCR反应和电泳时可设置阳性对照，便于排查出问题。

(1) 退火温度不合适：将退火温度设置梯度（比如2℃一个梯度）进行优化，选择适合反应的退火温度。

(2) DNA模板量过少或模板中存在抑制剂：适当增加DNA模板量；将模板纯化，确保DNA模板干净。

(3) PCR循环数不够：适当增加反应循环数。

(4) 引物量不够：适当增加反应体系中引物含量。

(5) 变性时间过长：变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

(1) 引物本身设计的不合理（比如设计的引物特异性差、引物自身具有互补性产生了引物二聚体）：重新设计引物，利用BLAST检查引物。

(2) 模板或引物浓度过高：适当降低反应体系中模板或引物浓度。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

(3) 酶的用量偏高或酶的质量不好：应降低酶量或更换其他的酶。

(4) Mg²⁺浓度偏高：根据实验要求适当调整Mg²⁺浓度。

(5) 退火温度偏低：适当提高退火温度，以减少与同源性非靶DNA的互补程度；也可以通过预实验设置梯度温度，选择最优的退火温度。

(6) 循环次数过多：适当增加模板用量，减少循环次数。

(7) 外源DNA污染：排查实验环境的影响，确认是否有外源DNA污染。

(1) 酶用量过多：减少用酶量，或使用热启动酶扩增以增加扩增特异性。

(2) 模板纯度较低：将模板纯化后再使用。

(3) 反应体系中dNTP、Mg²⁺浓度偏高：适当降低dNTP和Mg²⁺的浓度。

(4) 引物浓度不适合：对引物进行梯度稀释，优化选择适合实验的浓度。

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