(1)当相同的蛋白质在不同的SDS-PAGE缓冲系统（如Tris-Glycine、Bis-Tris、Tricine）中运行时，蛋白质的迁移率会产生轻微差异。

(2)不同缓冲液体系的pH值和离子强度会影响蛋白的电荷状态和迁移速率。每种SDS-PAGE缓冲系统均具有不同的pH值，因而会影响蛋白质的电荷及其与SDS的结合能力。

凝胶的类型和百分比选择不当会导致蛋白Marker条带的压缩或缺失，影响实验结果的准确性。使用合适的凝胶浓度可以确保不同分子量的蛋白条带能被准确分离。

(1)12.5%的胶适合8-180kDa范围的蛋白。

(2)低浓度胶可能导致低分子量的条带压缩。比如：8%的胶则会压缩10/15/25kDa条带。

目的蛋白的大小一般为理论分子量（根据组成氨基酸的数量计算出来的分子量），但由于蛋白质和多肽链的氨基酸残基组成和序列不同、结合SDS的量有差异、二硫键数量等不同，因此具有同样理论分子量的蛋白质其表观分子量常常与理论值有出入，有时甚至偏差很大。并且有时目的蛋白可能还存在侧链修饰，也会造成有差异。

条带弥散通常由水质、凝胶质量或电泳条件不当引起。定期检查试剂和设备，以确保实验条件的稳定性。

(1)尽量使用超纯水配制试剂。

(2)选用新鲜凝胶，避免长时间存放的凝胶影响分离效果。

(3)避免电压过高，参照使用说明书进行操作，防止过热。

(4)使用新鲜、预冷的电泳缓冲液。

不建议将预染Marker用于非变性凝胶电泳。

预染Marker通常经过变性和还原处理，因此它们在非变性条件下显示的分子量与变性电泳不一致，仅能作为电泳的相对标尺。

(1)上样量过多：建议按照说明书使用恰当的上样体积。

(2)电压过大：建议降低电压。

(3)分离胶表面不平：建议采用乙醇压平分离胶表面达到水平效果。

(4)凝胶过期：建议提前配制好的凝胶于4℃冰箱用缓冲液浸泡保存，并在一周内使用。

(5)胶未完全混匀易导致部分条带正常，部分条带“微笑型”。建议重新制备。

两侧有边缘效应：上样时保证每个泳道都加等体积且蛋白浓度相近的样品，如样品数量不够，可以用与样品等量的1X loading buffer补齐空孔。

通常情况下，转膜后Marker条带会更鲜亮，如果颜色变淡，可能有几种情况：

(1)转膜条件不适合，转膜时间过长可能透膜，转膜时间过短，蛋白可能残留在胶内。

(2)膜没有充分活化，甲醇浓度太高易造成蛋白穿膜，转移到滤纸上；未活化可能也可能导致膜吸附蛋白能力不强。

(3)转膜缓冲液中SDS添加量过高。建议不添加SDS，若实验必须使用，建议SDS浓度不要超过0.05%。

(4)洗膜缓冲液中吐温20的添加量过高，建议添加量低于0.05%。吐温20为粘稠性液体，在添加时小心移取，以免过量。若为商用洗膜缓冲液，建议稀释后再使用。

(5)较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，建议使用0.22μm孔径的膜。

按照标准操作流程，通常都可得到良好结果。如果出现蛋白条带穿膜而过的情况，重点检查以下几个因素：

(1)转印条件，建议降低电压、电流或缩短转印时间。

(2)确保转膜缓冲液的甲醇浓度和时长合适，转膜前使用浓度为10-20%的甲醇平衡PVDF膜，时间一般不超过30秒。

(3)SDS浓度适当。若实验必须使用，建议SDS浓度不要超过0.02-0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。

(4)检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10kDa，最好使用0.22μm孔径的膜。

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