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（1）载体自连：阴性对照长满菌落

原因：线性化载体未完全去磷酸化或残留环状质粒。

解决方案：载体纯化后进行去磷酸化处理；或采用双酶切法制备线性化载体，以防止自连。

（2）目的片段降解：电泳条带模糊

原因：核酸酶污染或反复冻融。

解决方案：纯化时可添加EDTA抑制核酸酶；或将目的片段分装保存，避免反复冻融。

（3）同源臂“对不上”：重组效率暴跌

原因：同源臂设计过短或存在错配。

解决方案：优化同源臂序列，延长同源臂至20-30bp；或提高退火温度。

（4）载体切口偏移：重组产物序列错乱

原因：酶切位点邻近同源臂，导致切割位置偏移。

解决方案：设计“安全距离”（一般酶切位点距离同源臂需≥5bp）；或精准制备线性化载体。

（5）宿主细胞“罢工”：转化后无克隆

原因：载体或片段残留抑制剂（如乙醇、酚类）。

解决方案：胶回收过程中，加入漂洗液后应用70%乙醇充分洗涤并彻底干燥；或使用超纯水溶解DNA，避免盐离子干扰。

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